Semua limbah biomedis yang akan diautoklaf harus dimasukkan terlebih dahulu ke dalam kantong autoklaf yang disetujui dan diberi label. Benda tajam seperti jarum dan pisau bedah harus ditempatkan dalam wadah benda tajam yang disetujui, diberi label, dan diberi tepi sebelum disterilkan. Jangan letakkan pipet tajam atau pecahan kaca di dalam tas. Limbah ini harus ditempatkan dalam kotak atau ember dan diautoklaf, atau disterilkan menggunakan cairan steril seperti natrium hipoklorit 10%. Limbah biomedis yang akan disterilkan dalam autoklaf harus memiliki indikator yang membuktikan bahwa limbah tersebut telah diautoklaf sebelum dapat dibuang. Banyak kantong autoklaf dilengkapi dengan indikator bertuliskan "AUTOCLAVED" ketika siklus sterilisasi selesai. Indikator harus diterapkan pada kotak dan tong sebelum diautoklaf dan ditempatkan di tempat sampah. Limbah yang berpotensi menular harus diberi label "biohazard" dan diberi label biohazard pada wadahnya. Ketika mensterilkan bahan-bahan yang tidak berbahaya seperti bahan-bahan penting untuk hewan penelitian, media kultur, dan peralatan laboratorium di lingkungan yang steril, wadah biasa yang tidak bertanda sudah cukup.
Sebelum memulai, kira-kira 50 ml – 100 ml air harus dimasukkan ke dalam kantong autoklaf untuk memudahkan pembentukan uap di dalam kantong. Jika air ini secara alami terdapat dalam muatan, maka tidak perlu menambahkan air tambahan. Kantong autoklaf harus dibungkus dengan baik untuk mencegah tumpahan jika terjadi. Namun, jika selotip dibungkus terlalu rapat, tekanan uap dapat menumpuk di dalam kantung sehingga menyebabkan kantung pecah. Jangan menggandakan kantong sampah Anda. Kantong autoklaf dirancang agar dapat ditembus uap, namun kantong ganda akan mencegah aliran uap melalui kantong. Jangan mengisi kantong atau autoklaf terlalu penuh karena aliran uap yang buruk dapat mengganggu proses sterilisasi. Sebaiknya jangan memasukkan kantong langsung ke dalam autoklaf. Mereka harus ditempatkan pada nampan baja tahan karat atau polipropilen.
Saat memautoklaf cairan, jangan mengisi wadah lebih dari 75%. Ini akan memastikan bahwa cairan memiliki ruang untuk mengembang saat memanas. Karena penggunaan steam untukmensterilkancairan dapat menimbulkan masalah, sebaiknya gunakan bahan kimia untuk mensterilkan limbah cair jika memungkinkan. Jika peneliti memilih menggunakan uap untuk mensterilkan cairan, maka wadah yang berisi cairan tersebut harus mampu tahan terhadap kondisi autoklaf. Wadah kaca borosilikat atau polipropilen dapat digunakan. Pastikan untuk melonggarkan tutup wadah untuk menambah tekanan selama proses berlangsung. Selama autoklaf, selalu tempatkan peralatan gelas dan wadah cairan ke dalam wadah sekunder. Kenakan sarung tangan tebal dan tahan panas, kacamata pengaman, dan celemek karet saat mengeluarkan cairan dari autoklaf. Untuk muatan cairan, siklus ventilasi autoklaf harus diatur sangat lambat. Hal ini memberikan waktu pada cairan untuk mendingin di bawah 100 derajat, sehingga tidak mendidih saat tekanan menurun. Setelah proses selesai, buka pintu secara perlahan dan mundur hingga uapnya hilang.
